本文關(guān)鍵詞:激光掃描共聚焦顯微鏡,顯微技術(shù)

定位、定量

三維重組

動(dòng)態(tài)測量

*活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+濃度的測量

*活細(xì)胞內(nèi)H+濃度( pH值)的測量

*自由基的檢測電動(dòng)轎車配件無縫管鎢絞絲聊城網(wǎng)絡(luò)公司激光雕刻機(jī)

*藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程、定位分布及定量

應(yīng)用:細(xì)胞膜電位的測量

熒光漂白恢復(fù)(FRAP)的測量

籠鎖解籠鎖的測量

熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)的測量

其他應(yīng)用

1.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針

(1)細(xì)胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細(xì)胞

碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞

Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞

Hochest 33258 (同上)

DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細(xì)胞

Chromomycin A3 450/470 DNA G-C

AO 500/526 DNA 活細(xì)胞

460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死細(xì)胞

SYTO 活細(xì)胞

(2)溶酶體 Lysosome中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標(biāo)記溶酶體等酸性器官為非特異性

AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細(xì)胞 LysoTracker Blue LysoTracker

Red

(3)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細(xì)胞 ¨細(xì)胞器的單克隆抗體 

(4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),較低濃度標(biāo)記線粒體

(5)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ,可染活細(xì)胞,陽離子性,可檢測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留時(shí)間短

JC1 線粒體膜電位低時(shí)為單體 490/527 發(fā)綠光

線粒體膜電位低時(shí)為多聚體 490/590 發(fā)紅光

可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體,且為檢測線粒體膜電

位較佳探針: Mitotracker Green FM 490/516, 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 ,

穩(wěn)定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 還原型, 只能染活細(xì)胞

2、定位、定量

免疫熒光標(biāo)記(單標(biāo)、雙標(biāo)或三 標(biāo))的定位、定量.如:細(xì)胞膜受體或抗原的分布,

微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位

細(xì)胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI

末端原位雜交-fitc + PI

熒光原位雜交: 染色體基因定位

單細(xì)胞凝膠電泳

GFP的表達(dá)

游離Ca2+ 的分布與定量

定位、定量研究中常用熒光探針

1)Amine-Reactive Probes與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針,可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等

1)FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512

2)TRITC 四甲基異硫氰基羅丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569

3)異硫氰基熒光素 494/518

4)PE 藻紅蛋白 565/578

5)Texas Red 德州紅 595/615 BODIPY TR592/618

6)cy5 650/690

7)cy3 490/530

(1)細(xì)胞膜表面受體

配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)

標(biāo)記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC

(2)細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白

免役熒光標(biāo)記: 與抗體耦聯(lián),

直標(biāo): 一抗+熒光探針電動(dòng)轎車配件無縫管鎢絞絲聊城網(wǎng)絡(luò)公司激光雕刻機(jī)

間標(biāo): 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白 抗 tublin抗體+熒光探針 肌動(dòng)蛋白 Palloidine+熒光探針

3. GFP 綠色熒光蛋白

GFP的的發(fā)現(xiàn):60年代,Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren),該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光.然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色,后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白電動(dòng)轎車配件無縫管鎢絞絲聊城網(wǎng)絡(luò)公司激光雕刻機(jī)

GFP, 后經(jīng)研究表明,在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后,水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光,GFP在藍(lán)激光的激發(fā)下,產(chǎn)生綠色熒光.將外源基因與GFP DNA

相連, GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測外源基因的表達(dá).

GFP主要應(yīng)用: 對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察

如: 可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中的時(shí)空表達(dá)

GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 可動(dòng)態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程

GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程:定位與定量測量應(yīng)注意的問題

定位:1.可以對(duì)圖像進(jìn)行修飾,

2.pinhole 可盡可能的小.

3.確認(rèn)共定位時(shí)要取兩個(gè)通道熒光相互干擾的對(duì)照圖像

定量:

1.儀器的各個(gè)條件必須一致

2.必須用原始圖像進(jìn)行定量測量

3.Pinhole盡可能的大

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